熒光定量早已是各個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。十年的變化很大。伴隨著測(cè)序成本的降低和科研經(jīng)費(fèi)支持的增加，熒光定量實(shí)驗(yàn)天天都做，天天都要處理和分析數(shù)據(jù)。
熒光定量技術(shù)已經(jīng)很普遍，但對(duì)于接觸它的人來說，總會(huì)遇到一些這樣那樣大大小小的問題，這些熒光定量實(shí)驗(yàn)中（染料法）的一些小技巧，相信你能用得上，助在PCR的路上一帆風(fēng)順，少走彎路。
熒光定量是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
熒光定量是實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)。研究基因在mRNA表達(dá)水平,以及驗(yàn)證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。
熒光定量的引物設(shè)計(jì)原則：
?。?）引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間，過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
（2）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計(jì)算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值。
?。?）引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
?。?）引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。
?。?）引物擴(kuò)增長(zhǎng)度：一般RT-PCR引物擴(kuò)增長(zhǎng)度在100-200bp。
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